ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM -AMILASE DARI KECAMBAH KACANG HIJAU

Oleh:

Herliani Lusiana

Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Jambi
herlianilusiana26@gmail.com

Abstrak

Didalam kecambah kacang hijau terkandung enzim yaitu -amilase. Enzim -amilase merupakan enzim yang mampu menganalisis, mengkatalisis proses hidrolisa pati untuk menghasilkan molekul lebih sederhana. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dengan cara sentrifugasi, serta untuk mengkarakterisasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dengan metode Fuwa menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Digunakan Larutan standar pati terlarut dengan 8 variasi konsentrasi yaitu 0,1 %; 0,2 %; 0,3 %; 0,4 %; 0,5 %; 0,6 %; 0,7 % dan 0,9 %. Persamaan kurva kalibrasi dari standar pati terlarut adalah y = 0,4087x + 0,4947 dengan nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,4815. Kecambah yang memiliki aktivitas paling tinggi adalah kecambah yang tumbuh selama 7 hari dengan penambahan daun sebagai sumber enzim -amilase dengan nilai absorbansi sebesar 0,744 A.

Kata kunci: Enzim -amilase, sentrifugasi, metode Fuwa, spektrofotometri UV-VIS

Abstract

In mung bean sprouts contained an enzyme that is -amylase. -amylase enzyme is an enzyme that is able to analyze, catalyze the process of hydrolysis of starch to produce simpler molecules. The purpose of this study was to isolate -amylase enzyme from mung bean sprouts by centrifugation, as well as to characterize -amylase enzyme from mung bean sprouts with Fuwa method using UV-VIS spectrophotometry. Used standard solution of starch dissolved in 8 variations of concentration at 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%; 0.5%; 0.6%; 0.7% and 0.9%. Standard calibration curve equation of dissolved starch is y = 0,4087x + 0,4947 with a correlation coefficient (r) of 0.4815. Sprouts that have the highest activity is growing sprouts for 7 days with the addition of the leaves as the source -amylase enzyme with the absorbance value of 0.744 A.

Keywords: -amylase enzyme, centrifugation, Fuwa method, UV-VIS spectrophotometry

PENDAHULUAN

Kacang hijau (Vigna radiata L.) merupakan salah satu komoditas tanaman kacang-kacangan yang banyak dimakan rakyat Indonesia. Kecambahnya dikenalah sebagai tauge. Tanaman ini mengandung zat-zat gizi, antara lain: amylum, protein, besi, belerang kalsium, minyak lemak, mangan, magnesium, niasin, vitamin (B1, A, dan E) (Atman, 2007).

Pertumbuhan merupakan suatu Proses pertambahan ukuran baik dalam bentul, volume, bobot, maupun jumlah sel akibat penggandaan protoplasma. Tahap awal pertumbuhan dimulai ketika biji berkecambah. Perkecambahan dimulai dengan penyerapan air dari lingkungan sekitar biji sehingga menyebabkan kulit biji melunak dan ukuran biji membesar (Salisburry dan Ross, 1995).

Enzim amilase merupakan enzim yang mampu menganilisis, mengkatalisis proses hidrolisa pati untuk menghasilkan molekul lebih sederhana seperti glukosa, maltosa dan dekstrin. Proses hidrolisa pati tersebut dilakukan melalui tiga tahapan yaitu, gelatinasi, likuifikasi, dan sakarifikasi. Ketiga tahapan tersebut memerlukan energi yang relatif tinggi sehingga meningkatkan biaya produksi pada produk berbahan pati (Nangin dan Sutrisno, 2015).

Potensi kecambah kacang hijau sebagai sumber enzim -amilase dilaporkan oleh Suarni dan Patong (2007). Hal yang sama juga dilakukan oleh Jamilatun et, al (2004) uang menggunakan kecambah dalam hidrolisis biji nangka untuk produksi glukosa. Amilase ini banyak digunakan dalam menghidrolisis molekul pati menjadi maltosa ataupun glukosa dan amilase juga berfungsi pada pembuatan roti dan makanan bayi (Sebayang, 2005).

Isolasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dilakukan dengan cara sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat berada di dasar tabung reaksi, sedangkan substansi yang ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama sentrifugasi dengan kecepatan bervariasi, contohnya 2500 rpm, (rotation per minute) atau 3000 rpm (Faatih, 2009).

Metode yang digunakan dalan penentuan aktivitas -amilase ini adalah dengan metode Fuwa, dan absorbansi diukur dengan spektrofotometer (Skoog dan West, 1971).

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dengan cara sentrifugasi, serta untuk mengkarakterisasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dengan metode Fuwa menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS.

METODOLOGI PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 28 September 2016 sampai 21 Oktober 2016 di Laboratorium Bioteknologi dan Rekayasa Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Jambi.

Alat

Adapun alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat gelas, mortal dan alu, alat sentrifugasi, inkubatir dan spektrofotometer UV-VIS.

Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kacang hijau, buffer asetat 0,2 M pH %, pati terlarut, larutan HCl 1 M, larutan KI/I₂ dan ddH₂O.

Penumbuhan Kecambah Kacang Hijau

Penelitian ini menggunakan perbandingan waktu pertumbuhan kecambah kacang hijau. Dimana parameter yang digunakan dalam pertumbuhan kecambah adalah 1 hari, 3 hari, 5 hari dan 7 hari.

Pertumbuhan kecambah kacang hijau dilakukan pada media berpori. Dilakukan dua perlakuan terhadap pertumbuhan kacang hijau pada masing-masing waktu yakni perlakuan pada tempat gelap dan tempat terang. Pertumbuhan kecambah dilakukan dengan cara disiapkan biji kacang hijau sebanyak-banyaknya. Lalu disortasi biji kacang hijau untuk memilih kacang hijau yang baik untuk digunakan menjadi kecambah. Sortasi dilakukan dengan cara dicuci terlebih dahulu kemudian direndam selama 30 menit. Setelah itu, dibuang kacang hijau yang terapung dan digunakan kacang hijau yang tenggelam sebagai sampel untuk dijadikan kecambah.

Isolasi Enzim -amilase dari Ekstrak Kecambah Kacang Hijau

Pembuatan ekstrak enzim dari kecambah kacang hijau dengan masing-masing waktu pertumbuhan. Pertama dibersihkan dengan melepaskan kulit luar kecambah, ditimbang sebanyak 3 g masing-masing untuk kecambah ditempat gelap dan terang. Masing-masing kecambah dihaluskan dengan mortal. Masing-masing kecambah halus dimasukkan kedalam gelas kimia 25 mL. Kemudian ditambahkan 15 mL buffer asetat 0,2 M pH 5 kedalam masing-masing kecambah halus. Didiamkan selama 10 menit. Setelah itu, disaring dan diambil filtrat masing-masing kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu 5 °C. Supernatan yang dihasilkan diinkubasi didalam inkubator. Inkubasi dilakukan selama 7 hari.

Pembuatan Kurva Kalibrasi

Pembuatan kurva kalibrasi. Dibuat larutan pati dengan berbagai konsentrasi yakni: 0,1 %; 0,2 %; 0,3 %; 0,4 %; 0,5 %; 0,6 %; 0,7 % dan 0,9 %. Masing masing larutan pati 200 µL ditambah 200 µL larutan HCl 1 M, 200 µL larutan KI/I₂ dan 3,4 mL ddH₂O. Diukur absorbansi masing-masing pada panjang gelombang 600 nm.

Penentuan Aktivitas Enzim -amilase

Penentuan aktivitas enzim -amilase dengan menambahkan 200 µL larutan pati 0,5 % dengan 200 µL enzim -amilase dari kecambah dengan beberapa parameter tersebut, lalu ditambah 200 µL larutan HCl 1 M, 200 µL larutan KI/I₂ dan 3,4 mL ddH₂O. Diukur aborbansi pada panjang gelombang 600 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi enzim -amilase diperoleh dari kecambah kacang hijau. Kecambah didapat dari proses penumbuhan biji kacang hijau yang sudah disortasi. Sortasi  ini dilakukan untuk memisahkan dan memilih biji kacang hijau yang baik dijadikan kecambah. Dimana kecambah yang terapung adalah kecambah yang tidak dapat digunakan sebagai kecambah karena kacang hijau yang terapung memiliki komposisi yang rusak sehingga tidak bisa tumbuh menjadi kecambah dengan baik. Sedangkan biji kacang hijau yang terapung merupakan kacang hijau yang baik untuk dijadikan kecambah karena komposisi yang dimiliki kacang hijau masih dalam keadaan baik.

Variasi waktu pertumbuhan ditujukan untuk melihat aktivitas dari enzim -amilase. Dilakukan 4 variasi waktu tumbuh kecambah kacang hijau yakni, 1 hari, 3 hari, 5 hari dan 7 hari. Perlakuan terhadap masing-masing hari dibedakan lagi antara kecambah yang tumbuh ditempat gelap dan kecambah yang tumbuh ditempat terang. Hal ini juga ditujukan untuk melihat kemampuan atau aktivitas dari enzim -amilase yang ada pada kecambah.

Tabel 1. Data hasil pengamatan pertumbuhan dan perkembangan kacang hijau dengan berbagai variasi waktu pertumbuhan

Hari ke	Pengamatan Pertumbuhan dan Perkembangan Kacang Hijau
	Tempat Gelap	Tempat Terang
0	Masih berupa biji	Masih berupa biji
1	Tumbuh akar ± 0,5 cm	Tumbuh akar ± 0,5 cm
3	·  Batang memanjang ± 3-4 cm ·  Muncul daun kecil berwarna kuning	·    Batang memanjang ± 5-7 cm ·    Muncul daun sedikit lebih panjang berwarna kuning
5	·  Batang memanjang ± 7-8 cm ·  Daun mulai melebar warna lebih pucat	·    Batang memanjang hingga 10 cm ·    Lebar daun ± 1,5 cm berwarna hijau tua
7	·  Batang mencapai 10 cm ·  Daun tidak terlalu hijau	·    Panjang batang mencapai 15 cm ·    Lebar daun ± 2 cm berwarna hijau pekat

Dari Tabel 1. Dapat dilihat perbandingan pertumbuhan dan perkembangan yang terjadi antara kecambah yang tumbuh pada tempat gelap dan terang. Dimana kecambah yang tumbuh pada tempat gelap cenderung berwarna kuning karena kekurangan cahaya dan pertumbuhan batangnya cenderung lebih lambat. Sedangkan kecambah yang tumbuh pada tempat terang cenderung lebih hijau dan lebih segar serta pertumbuhan batangnya lebih tinggi karena menerima asupan cahaya yang cukup.

                 

       Gambar 1. Tempat gelap                                                   Gambar 2. Tempat terang

Isolasi dilakukan dengan dengan penghalusan kecambah dengan mortal dan alu. Penghalusan ini bertujuan untuk menghancurkan jaringan dan  dinding sel agar mudah untuk memisahkan atau mengisolasi enzim -amilase.

Tabel 2. Hasil isolasi

 enzim -amilase untuk kecambah yang tumbuh selama 3 hari

Perlakuan	Hasil
	Tempat Terang	Tempat Gelap
Kecambah yang ditambah buffer lalu didiamkan 10 menit	Warna cokelat terang	Warna keruh
Sentrifugasi 10 menit	Ada endapan	Ada endapan

Sentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit diperoleh hasil endapan yang sangat sedikit terlihat di dasar tabung reaksi. Hasil sentrifugasi diinkubasi dengan tujuan agar enzim yang terdapat di dalamnya tidak rusak akibat suhu yang terlalu ekstrim karena untuk penggunaan dalam jangka waktu  yang panjang dapat memicu kerusakan bagi enzim tersebut.

Tabel 3. Kurva kalibrasi

Konsentrasi(%)	Panjang gelombang(nm)	Absorbansi(A)
0,1	600	0,313
0,2	600	0,622
0,3	600	0,735
0,4	600	0,759
0,5	600	0,757
0,6	600	0,760
0,7	600	0,761
0,9	600	0,763

Pembuatan kurva kalibrasi adalah dengan menggunakan larutan standar yakni pati terlaru dengan berbagai konsentrasi, 0,1 %; 0,2 %; 0,3 %; 0,4 %; 0,5 %; 0,6 %; 0,7 %; dan 0,9%. Dari hasil absorbansi diperoleh persamaan garis regresi dari pati terlarut adalah y = 0,4087x + 0,4947 dengan nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,4815. Dapat dilihat pada gambar 1 kurva kalibrasi larutan pati terlarut. Nilai korelasi yang diperoleh cukup jauh dari 1 yakni 0,4815, hal ini dapat terjadi disebabkan kesalahan yang munkin terjadi pada saat pengenceran pati dan pada saat penambahan larutan lain.

Gambar 3. Kurva kalibrasi pati terlarut

Pengujian aktivitas enzim -amilase dilakukan dengan melihat absorbansi dari enzim -amilase tersebut. Aktivitas enzim -amilase dilakukan dengan menggunakan larutan iodin melalui metode Fuwa. Larutan iodin memiliki warna dasar kuning. Namun, ketika direaksikan dengan pati akan membentuk kompleks berwarna biru. Amilum merupakan polimer sakarida yang berbentuk helix. Ketika ditambahkan iodin, iodin akam masuk ke dalam spiral amilum dan membentuk warna biru kehitaman.

Tabel 4. Absorbansi enzim -amilase kecambah kacang hijau (pertama)

Hari ke-	Perlakuan	Panjang geolombang (nm)	Absorbansi (A)
1	Terang	600	0,686
	Gelap	600	0,728
3	Terang	600	0,396
	Gelap	600	0,256
5	Terang dengan daun	600	0,701
	Terang tanpa daun	600	0,580
	Gelap	600	0,359
7	Terang dengan daun	600	0,744
	Terang tanpa daun	600	0,763
	Gelap	600	0,189

Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat perbedaan daya serap atau absorbansi dari enzim -amilase. Dimana enzim yang berasal dari kecambah yang tumbuh di tempat terang memiliki absorbansi yang lebih tinggi dibanding kecambah yang tumbuh di tempat gelap. Hal ini disebabkan oleh perbedaan asupan yang diterima oleh kecambah pada tempat terang berbeda dengan kecampah pada tempat gelap. Kekurangan asupan cahaya dari kecambah pada tempat gelap mengakibatkan pertumbuhan kecambahnya menjadi tidak baik. Pada perlakuan kecambah dengan waktu tumbuh selama 3 hari diperoleh nilai absorbansi yang terlalu jauh yakni sebesar 0,396 A dan 0,256 A. Hal ini dapat disebabkan karena kurangnya nutrisi yang diperoleh pada kecambah ini. Oleh sebab itu, enzim -amilase yang terdapat didalam kecambah tersebut sedikit. Dibandingkan pula pada kecambah dengan waktu 5 hari dan 7 hari yang diberi perlakuan berbeda pada kecambah di tempat terang yakni dengan penambahan daun kecambah dan tanpa daun kecambah. Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat perlakuan dengan menggunakan daun memiliki absorbansi yang lebih tinggi dibanding dengan perlakuan tanpa daun.

Sebagai perbandingan dilakukan pengulangan dengan metode dan bahan yang sama serta perlakuan yang sama.

Tabel 5. Absorbansi enzim -amilase kecambah kacang hijau (kedua)

Hari ke-	Perlakuan	Panjang geolombang (nm)	Absorbansi (A)
3	Terang	600	0,775
	Gelap	600	0,749
5	Terang dengan daun	600	0,716
	Terang tanpa daun	600	0,599
	Gelap	600	0,497
7	Terang dengan daun	600	0,540
	Terang tanpa daun	600	0,775
	Gelap	600	0,667

Pada pengulangan ini diperoleh data yang lebih baik dari sebelumnya, dimana absorbansi teradap enzim -amilase lebih kecil. Semakin lama waktu tumbuh kecambah nilai absorbansi semakin kecil hal ini disebabkan karena jumlah enzim yang semakin berkurang. Pada penelitian sebelumnya dijelaskan oleh Bahri, et al (2012) perkecambahan diperlukan energi yang cukup besar, utnuk itu diperlukan enzim amilase yang banyak untuk merombak karbohidrat. Setelah waktu tertentu, fase perkecambahan akan dialihkan menjadi fase pertumbuhan, sehingga pembentukan enzim amilase akan menurun.

Berbeda dengan penelitian pertama terhadap enzim -amilase hal ini dapat dipengaruhi oleh beberapa sebab, seperti jumlah nutrien yang diterima oleh kecambah sehingga menghasilkan enzim -amilase, kesalahan atau ketidaktepatan lainnya yang terjadi ketika pembuatan atau penyiapan larutan uji untuk uji spektrofotometer UV-VIS.

KESIMPULAN

Untuk mengisolasi enzim -amilase dari kecambah kacang hijau dapat dilakukan dengan cara sentrifugasi. Dari absorbansi yang diperoleh pada pengulangan kedua diperoleh nilai absorbansi yang sesuai dengan teori bahwa semakin lama waktu tumbuh kecambah maka enzim -amilase semakin berkurang karena fungsinya semakin menurun untuk pertumbuhan kecambah. Sedangkan pada penelitian pertama didapat absorbansi yang sebaliknya. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor seperti, nutrisi kecambah yang kurang dan ketidaktepatan dalam pembuatan larutan uji untuk uji spektrofotometer UV-VIS.

DAFTAR PUSTAKA

Atman. 2007. “Teknologi Budidaya Kacang Hijau (Vigna Radiata L.) di Lahan Sawah”. Jurnal Ilmiah Tambua. Vol. VI. No. 1: (89-95).

Bahri, Syaiful., Moh. Mirzan dan Moh. Hasan. 2012. “Karakterisasi Enzim Amilase dari Kecambah Biji Jagung Ketan”. Jurnal Natur Science. Vol. 1. No. 1: (132-143).

Faatih, Mukhlissul. 2009. “Isolasi dan Digesti DNA Kromosom”. Jurnal Sains dan Teknologi. Vol. 10. No. 1: (61-67).

Jamilatun, S., Sumiyati, Y. dan Handayani, R.N. 2004. Pengambilan Glukosa dari Tepung Biji Nangka dengan Cara Hidrolisis Enzimatik Kecambah Jagung. Yogyakarta: Prosiding Seminar Nasional Reyasa Kimia dan Proses.

Nangin, Debora dan Aji Sutrisni. 2015. “Enzim Amilase Pati Mentah dari Mikroba: Kajian Putaka”. Jurnal Pangan dan Hasil Agroindustri. Vol. 1. No. 3: (1032-1039).

Salisburry dan C.W. Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Bandung: ITB.

Sebayang, F. 2005. “Isolasi dan Pengujian Aktivitas Enzim -amilase dari Aspergillus niger dengan Menggunakan Media Campuran Onggok dan Dedak”. Jurnal Komunikasi Penelitian. Vol. 17. No. 5: (81-86).

Skoog, D.A. dan D.M. West. 1971. Principles of Instrumental Analysis. New York: Holt, Rinehart and Winston, Inc.

Suarni dan Patong, R. 2007. “Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber Enzim -amilase”. Indo Chem. Vol. 7: (332-336).